马氏珠母贝外套膜不同区域基因组DNA甲基化MSAP分析

       摘要: 通过甲基化敏感多态性扩增(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术,检测马氏珠母贝(Pinctada martensii)外套膜的边缘膜区(mantle edge, Me)、套膜区(mantle pallial, Mp)和中央膜区(mantle central, Mc)的基因组DNA甲基化修饰水平;回收具特异性的清晰甲基化修饰片段进行测序、比对分析并筛选基因;利用荧光定量PCR对筛选基因进行定量分析。结果显示:(1)利用15对引物进行扩增实验,平均每个个体外套膜3个区域能够产生(1163.25±124.34)条清晰可辨的条带,其中Me、Mp和Mc分别得到(401.00±40.37)条、(380.63±52.39)条和(381.63±53.57)条扩增条带,各组织甲基化总条数差异不显著(P>0.05); Me、Mp和Mc的基因组甲基化水平分别为(17.07±2.19)%、(15.48±2.34)%和(19.61±2.88)%, Mc和Mp具有显著性差异(P<0.05);组织间的基因组甲基化水平由高到低排列依次是Mc > Me > Mp。(2)对特异性片段进行回收、测序后,经在线及本地Blast比对,得到8条存在甲基化修饰的基因序列,其中3条有同源序列,基因注释为40S核糖体蛋白SA (40S ribosomal protein SA)、iHog (interference hedgehog)、锌指蛋白(zinc finger protein castor)。iHog仅在中央膜上具有全甲基化修饰,且E值较低,为筛选的目的基因。(3)荧光定量结果表明iHog在Me、Mp和Mc中均有表达,以Me表达量最高, Mc表达量最低,差异显著(P<0.05)。我们推测iHog的DNA序列的甲基化修饰抑制了该基因在Mc组织中的表达。综上研究结果表明,马氏珠母贝外套膜3个区域的甲基化修饰水平不一,且DNA甲基化在基因表达调控中具有作用,这对深入研究珍珠贝生物矿化和免疫反应机制具有一定的参考意义。

作者:
罗少杰 邓岳文 郑哲 焦钰 王庆恒
单位:
广东海洋大学水产学院,广东湛江,524025 广东海洋大学水产学院,广东湛江 524025; 广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心,广东湛江 524025
出处:
《中国水产科学》
刊期:
2016年第23卷第6期
基金:
国家自然科学基金资助项目(41206141,31372526) 广东省科技计划项目(2013B020201002)

马氏珠母贝外套膜不同区域基因组DNA甲基化MSAP分析

摘要: 通过甲基化敏感多态性扩增(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术,检测马氏珠母贝(Pinctada martensii)外套膜的边缘膜区(mantle edge, Me)、套膜区(mantle pallial, Mp)和中央膜区(mantle central, Mc)的基因组DNA甲基化修饰水平;回收具特异性的清晰甲基化修饰片段进行测序、比对分析并筛选基因;利用荧光定量PCR对筛选基因进行定量分析。结果显示:(1)利用15对引物进行扩增实验,平均每个个体外套膜3个区域能够产生(1163.25±124.34)条清晰可辨的条带,其中Me、Mp和Mc分别得到(401.00±40.37)条、(380.63±52.39)条和(381.63±53.57)条扩增条带,各组织甲基化总条数差异不显著(P>0.05); Me、Mp和Mc的基因组甲基化水平分别为(17.07±2.19)%、(15.48±2.34)%和(19.61±2.88)%, Mc和Mp具有显著性差异(P<0.05);组织间的基因组甲基化水平由高到低排列依次是Mc > Me > Mp。(2)对特异性片段进行回收、测序后,经在线及本地Blast比对,得到8条存在甲基化修饰的基因序列,其中3条有同源序列,基因注释为40S核糖体蛋白SA (40S ribosomal protein SA)、iHog (interference hedgehog)、锌指蛋白(zinc finger protein castor)。iHog仅在中央膜上具有全甲基化修饰,且E值较低,为筛选的目的基因。(3)荧光定量结果表明iHog在Me、Mp和Mc中均有表达,以Me表达量最高, Mc表达量最低,差异显著(P<0.05)。我们推测iHog的DNA序列的甲基化修饰抑制了该基因在Mc组织中的表达。综上研究结果表明,马氏珠母贝外套膜3个区域的甲基化修饰水平不一,且DNA甲基化在基因表达调控中具有作用,这对深入研究珍珠贝生物矿化和免疫反应机制具有一定的参考意义。

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