摘要: 试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料.通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞.本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白.试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义.