摘要: 为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species, ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d) ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示：(1) DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内 ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P<0.05)和(2.31±0.08)倍(P<0.05)。(2) Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK (p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞 ROS 的产生；通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现 p-JNK、p-p38和γH2A.X 激活时间点与低温诱导 ROS 表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。